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实战经验丨竞争性ELISA:受体蛋白包被浓度及配体蛋白-Tag饱和浓度的确定

更新时间:2023-12-13 浏览次数:429

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ELISA试剂盒


01 

·Tag饱和浓度的确定:

1. 包被:用1×包被液将受体蛋白稀释若干个浓度(如2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL),每孔加入100µL包被液,4℃包被过夜(确定最佳包被浓度);

2. 洗涤:弃去(或回收)板内液体,用PBST洗涤液(0.05%吐温20)每孔200µL,每次洗涤3min,洗涤3次,拍干;

3. 封闭:加入封闭液(1%BSA溶液),每孔200 µL,保鲜膜包裹酶标板,放置于37℃水浴锅中,水浴1h;

4. 配制配体蛋白-Tag溶液:用样品稀释液将配体蛋白-Tag稀释至1 µg/mL(稀释液为0.5% BSA),3倍系列稀释,共10个梯度(封闭结束前半小时,防止样品变质);

5. 加样:每孔加入100 µL配制好的配体蛋白-Tag溶液,保鲜膜包裹后,放置于37℃水浴锅中水浴2h;

6. 洗涤:弃去板内液体,用PBST洗涤液每孔200µL,每次洗涤3min,洗涤3次,拍干。

7. 加酶标二抗:每孔加入100 µL二抗溶液(稀释液为0.5% BSA),37℃水浴锅中水浴1.5 h;

8. 洗涤:弃去板内液体,用PBST洗涤液每孔200µL,每次洗涤3min,洗涤5次,拍干;

9. 显色:每孔加入100µl显色液(TMB),显色15 min;

10. 终止:每孔加入50 µL 10%硫酸终止;

11. 检测:酶标仪检测OD450和OD630的吸光度值。

注:最终依据拟合的浓度-吸光度曲线,确定合适的受体蛋白包被浓度,并且同时确定该包被浓度下的配体蛋白饱和浓度。


02 

1. 用先前确定的最佳的受体蛋白包被浓度包被板子,同上述条件洗涤,封闭;

2. 配置不同起始浓度的待测抗体:用样品稀释液将待测抗体稀释若干个浓度(如80 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL),再将上述稀释液进行3倍稀释,共10个梯度(封闭结束前半小时,防止样品变质);

3. 在受体蛋白包被板中加入2倍饱和浓度的配体蛋白-Tag溶液,每孔50 µL,立即加入50 µL系列稀释的待测抗体,保鲜膜包裹后,放置于37℃水浴锅中水浴2h;

4. 洗涤:弃去板内液体,用PBST洗涤液每孔200µL,每次洗涤3min,洗涤3次,拍干。

5. 加酶标二抗:每孔加入100 µL二抗溶液(稀释液为0.5% BSA),37℃水浴锅中水浴1.5 h;

6. 洗涤:弃去板内液体,用PBST洗涤液每孔200µL,每次洗涤3min,洗涤5次,拍干;

7. 显色:每孔加入100µL显色液(TMB),显色15 min;

8. 终止:每孔加入50 µL 10%硫酸终止;

9. 检测:酶标仪检测OD450和OD630的吸光度值。


总结

ELISA实验是实验室十分常规的检测手段,总体操作难度不大,但由于操作步骤繁多,且结果较为灵敏,容易出现结果差异较大的现象,因此需要格外注意上样的顺序及加样量,以保证尽可能缩小误差。竞争性ELISA较普通ELISA实验额外多出一个实验组分,需要在开展正式实验之前尽可能多摸索几个各个组分的工作浓度,以保证最终的结果在较好的范围内呈现。


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